Dra. Carolina Sousa Martín.
Prof. Departamento Microbiología y Parasitología.
Facultad de Farmacia.
Universidad de Sevilla.

La enfermedad celíaca es un trastorno autoinmunitario provocado por el gluten, una proteína presente en cereales. Debido a la prevalencia cada vez mayor de esta enfermedad, y a las dificultades que surgen al realizar el tratamiento dietético, sería conveniente diseñar terapias alternativas que permitan al celíaco disfrutar de una mayor calidad de vida.

El gluten es una mezcla de proteínas individuales, que se encuentra presente, entre otros, en el trigo, el centeno, la cebada y sus derivados. En el caso del trigo la fracción proteica implicada principalmente en la enfermedad celíaca es la gliadina, que es una mezcla compleja de polipéptidos, que se encuentra presente en el endosperma de la semilla. La gliadina es una proteína inusualmente rica en glutamina y prolina, demostrándose que la estructura peptídica es esencial para producir el efecto tóxico, ya que cuando los polipéptidos de la gliadina se hidrolizan hasta los aminoácidos constituyentes, se pierde la capacidad lesiva para el intestino.

El desarrollo de esta enfermedad se desencadena como consecuencia de la presencia de péptidos de la fragmentación de la gliadina, que no son digeridos por proteasas de nuestro propio organismo, y resultan tóxicos para el enfermo celíaco.

Entre los péptidos tóxicos identificados el denominado 33-mer, parece ser uno de los responsable de la reacción inmune que se desencadena en el intestino de los pacientes celiacos (Shan et al., 2002. Science 297:2275-2279; Shan et al., 2004. Biochem J. 383:311-318). Estos péptidos pasan por la mucosa intestinal donde interaccionan con la transglutaminasa tisular, que transforma los residuos de glutamina en ácido glutámico, como consecuencia de ello se producen una serie de cambios que desencadenan reacciones con base inmunológica, que acaban destruyendo las vellosidades intestinales.

Por lo tanto, un entramado de predisposición genética, procesos bioquímicos modificadores de la proteína desencadenante y una respuesta inmune compleja mediada por las células T a nivel del intestino delgado, contribuyen al desarrollo de esta enfermedad que presenta diferentes formas clínicas.

Con estos antecedentes, nuestra investigación está encaminada a explorar una terapia basada en enzimas capaces de eliminar fracciones tóxicas del gluten, ya que hasta la fecha una dieta exenta de gluten es el único tratamiento que existe para la enfermedad celíaca.

El primer objetivo para abordar este estudio fue desarrollar un ensayo sencillo que permitiera detectar la degradación del péptido 33-mer. Para ello, realizamos la clonación, producción y purificación del péptido 33-mer de la gliadina, que lo utilizaremos en posteriores ensayos, entre ellos la obtención de una familia de anticuerpos monoclonales.

En colaboración con el grupo del Dr. Manuel C. López (Instituto López-Neyra, C.S.I.C., Granada) se obtuvo un anticuerpo monoclonal frente al péptido tóxico. Una vez valorado y analizada la especificidad del anticuerpo anti-33-mer por su antígeno correspondiente, se comprobó la capacidad del mismo para detectar gliadina en alimentos con y sin gluten. Posteriormente, utilizando la técnica de ELISA, se evaluó la cantidad mínima de péptido tóxico que es posible detectar por el anticuerpo monoclonal obtenido, tanto purificado como formando parte de una mezcla compleja (gliadina, gluten y alimentos).

Gracias a la obtención de anticuerpos monoclonales se podrán realizar ensayos de degradación del péptido purificado por prolil-endopeptidasas específicas, pudiendo determinar las condiciones óptimas de digestión requeridas para eliminar el péptido tóxico hasta niveles detectables por el anticuerpo. Posteriormente, estos experimentos se realizarán en muestras complejas y en hidrolizados de gluten. Para llevar a cabo estos ensayos hemos clonado la prolil-endopetidasa de Flavobacterium meningosepticum descrita como activa frente a dicho péptido (Chevallier et al., 1992. J. Biol.. Chem. 267:8192-8199), con la finalidad de sobreproducirla y purificarla mediante una nueva tecnología de expresión de proteínas recombinantes en microorganismos, con una excelente relación coste-eficiencia (Cebolla et al., 2001. Nucleic Acids Res. 29:759-766).

Hasta la fecha, sólo se han aislado tres prolil-endopeptidasas eficaces frente al péptido tóxico 33-mer (Shan et al., 2004. Biochem J. 383:311-318) por ello, estamos realizando una búsqueda de nuevas proteasas en colecciones de microorganismos, capaces de destruir los péptidos tóxicos que se generan en la digestión del gluten presente en los cereales. La obtención de los anticuerpos monoclonales, para la detección por ELISA del péptido tóxico, es primordial en los futuros ensayos a realizar con las proteasas específicas, para poder determinar las condiciones fisiológicas idóneas de ensayo del enzima.

Finalmente, todas estas investigaciones están enfocadas a obtener una herramienta fácil con el objetivo de analizar proteasas que puedan permitir al enfermo celíaco consumir alimentos con gluten.